Za svoje delo je bil večkrat nominiran in nagrajen ter postal pri 82 najstarejši nominiranec, saj je bil za igranje v filmu V divjino (2007) nominiran za oskarja za najboljšo stransko vlogo.

Mark Twain je zaznamoval njegovo življenje
Čeprav se je rodil v Ohiu, je večino otroštva preživel v Massachussettsu. Po vojaški akademiji se je vpisal na fakulteto, kjer je študiral igro. Študij igralstva je prekinil zaradi druge svetovne vojne, kjer je bil tri leta inženir na Novi Fundlandiji, nato pa se znova vrnil na fakulteto. Za zaključek študija si je izbral imitiranje Marka Twaina in si ravno s tem utrl pot v Hollywood. Na začetku svoje kariere je poleg igranja v predstavi o Marku Twainu za dodaten zaslužek igral tudi v telenoveli The Brighter Day. Leta 1956 so ga povabili k sodelovanju na CBS, da bi na televiziji predvajali varietejsko predstavo o Twainu. Leta 1966 se je s predstavo prvič pojavil na Broadwayju in istega leta prejel nagrado tony.

Pozneje je napisal knjigo o svojih izkušnjah, ki jo je naslovil Mark Twain Tonight! An Actor's Portrait. Twain je bil inspiracija tudi za drugo knjigo, v kateri so zbrani njegovi spomini.

Holbrook meni, da igralec v gledališču predstavi svoj lik s telesno govorico, artikulacijo in obnašanjem, medtem ko to v filmu ni potrebno, saj je karakterizacije zelo malo. Sredina 60-ih in začetek 70-ih je bilo pomembno obdobje za Holbrooka, tako za njegovo predstavo o Twainu kot delo v filmski industriji in na televiziji. Zaigral je v več uspešnih filmih, in sicer Wild in the Streets (1968), The People Next Door (1968) in v prvem delu Umazanega Harryja (1971). Leta 1976 je igral v trilerju Vsi predsednikovi možje, ki mu je prinesel eno izmed najbolj prepoznavnih vlog. Za vlogi kapitana Lloyda Bucherja v televizijskem filmu Pueblo in Abrahama Lincolna v TV-seriji Sandburg's Lincoln je bil nagrajen z emmyjem. Pravzaprav je imela televizija v njegovi karieri pomembno vlogo, saj so bile vloge v filmih samo občasne.

V televizijskem filmu Murder by Natural Causes (1979) je zaigral s Katherine Ross, in leto pozneje igral očeta najstnika, ki je pobegnil v filmu Off the Minnesota Strip. Sodeloval je tudi mini serijah Sever in Jug (1985) in v North and South Book II. V tem času je imel stalno vlogo v komediji Designing Women na CBS, kjer je spoznal svojo tretjo ženo Dixie Carter. V slovenskih kinematografih ste ga lahko gledali v drami Voda za slone in v animirani družinski pustolovščini Avioni 2: V akciji, sicer pa je igral v številnih serijah, kot so Sopranovi, Pri sestri doma, Sinovi anarhije, Zahodno krilo idr. ter pred tremi leti zaigral tudi v filmu Stevena Spielberga Lincoln (2012), ki je bil nominiran za oskarja.

Najraje se zadržuje v hiši, ki ga spominja na Marka Twaina
Bil je trikrat poročen in ima tri otroke. Prvič se je poročil z Ruby leta 1945, s katero imata dva otroka. Ločila sta se dvajset let pozneje in leto pozneje se je že drugič poročil s Carol Eve Rossen, s katero ima enega otroka. Leto po ločitvi pa je zaživel z Dixie Carter, s katero sta bila skupaj do njene smrti leta 2010. Zdaj večino prostega časa najraje preživi v hiši, ki ga spominja na Twainovo hišo v Connecticutu in pravi, saj pravi, da se v njej počuti zelo udobno.